Sebbene la cannabis sia stata una fra le prime specie vegetali a essere coltivata e addomesticata dall’uomo, a causa del proibizionismo molte aree strettamente scientifiche legate al growing risultano parzialmente inesplorate.

Negli ultimi anni, di riflesso alla legalizzazione in USA e in altri Paesi, si sta assistendo a un’inversione di tendenza e a un rinnovamento generale sia nelle strategie di mercato che nelle tecniche adottate per la produzione, la ricerca e la genetica con un adeguamento agli standard delle tecnologie utilizzate nell’ambito agroalimentare, industriale, medico e scientifico.

Uno di questi adeguamenti, a vantaggio di un prodotto più stabile, standardizzato e virus esente, a seconda degli utilizzi (siano essi farmaceutici, alimentari o ricreazionali), è proprio la Tissue Culture. Fino a qualche anno fa infatti, la Tissue Culture (TS), veniva prettamente utilizzata nell’ambito dell’industria florovivaistica, in quella agroalimentare e in quella relativa a mirati studi di carattere genetico in ambiente scientifico. Oggigiorno però, la maggior parte delle più quotate farm, hanno iniziato ad emulare le grandi aziende agricole attingendo così a questa tecnica, insolita per i canapicoltori tradizionali.

Ma che cos’è la Tissue Culture?
Spesso quando si sente parlare di riproduzione asessuata o agamica delle piante, si tende ad associare queste parole alla riproduzione e propagazione per talea, propaggine o margotta, previo l’utilizzo di una donatrice detta “pianta madre”. Lo scopo è quello di ottenere in serie una quantità di cloni, aventi specifiche caratteristiche note della pianta selezionata per il prelievo. Allo stesso modo, si può clonare una pianta su scala ridotta, prelevando piccolissime porzioni di tessuto (lembi di foglia, parti di fusto, rami, germogli ecc.) e far sviluppare delle vere e proprie piante da queste porzioni, apparentemente insignificanti, di cellule.
Questo tipo di clonazione viene chiamata Tissue Culture o più comunemente micropropagazione. La tecnica della micropropagazione in vitro da cellule vegetali vide la sua alba nei primi del ‘900 con Gottlieb Haberlandt (botanico e biologo Austro-Ungarico), che prese spunto dal concetto di totipotenza introdotto nel 1838/39 da M. J. Schleiden e T. Schwann.

Prima di addentrarci nell’argomento, è bene rispondere ad alcune domande su questa teoria:
Che cos’è la totipotenza? La totipotenza è quella capacità di generare un individuo completo, a partire da un insieme di cellule e tessuti “differenziati”.

Cosa si intende per differenziazione?
La differenziazione è quella capacità che hanno alcune cellule di regredire da una forma (indifferenziata) verso uno stato meristematico specializzato. A questo stato vi si arriva attraverso dei particolari processi, ovvero inducendo (sotto stretto controllo umano e ambientale) gruppi o singole cellule alla costruzione di una pianta intera. Le condizioni principali affinché questo compito di specializzazione abbia inizio e si concluda, sono prevalentemente queste:
• Condizioni asettiche
• Luce artificiale (fonte luminosa)
• Terreno di coltura specifico
• Fonti di carbonio
• Fonti di azoto
• Vitamine, zuccheri
• Ormoni
• PH “specifico”
• Condizioni climatiche controllate

Tempo, spazio e risparmio di risorse
Ponendo a confronto le tecniche classiche di riproduzione e selezione con la micropropagazione in vitro osserveremo in quest’ultima diversi benefici, sia in termini economici sia di spazio, di tempo e di qualità.
Facciamo un esempio: oltre al mantenimento delle piante donatrici, i cloni da talea richiedono costanti attenzioni giornaliere, con il relativo dispendio di acqua, fertilizzanti e elettricità, per mantenere il controllo ambientale di spazi considerevolmente grandi, ai quali si aggiunge la manodopera e tanto altro. Tutti questi fattori vanno a moltiplicarsi notevolmente se prendiamo in considerazione impianti professionali di scala industriale.
La tecnica della micropropagazione conta sostanzialmente di manutenzione, spazi e strumenti di gestione relativamente più congrui e sistematici rispetto alle colture tradizionali, che prevedono un utilizzo di elevate superfici con relativo dispendio di risorse ad esso connesse. Con la TS infatti non occorre un’irrigazione continua, non occorre un utilizzo frequente di fertilizzanti e concimi, e non interviene la manutenzione ordinaria operata da mezzi agricoli; si ha invece la possibilità di generare migliaia di piccole piante in un periodo di tempo ragionevolmente breve e in spazi relativamente ristretti. Ecco perché si rivela non solo un valido metodo di clonazione, ma anche un efficace strumento per la conservazione di germoplasma in merito alla biodiversità delle coltivazioni, con la possibilità di creare un vero e proprio archivio genetico in piccoli spazi.

Scaffale con illuminazione tubi neon

Difficoltà, criticità e raccomandazioni generali
Nella sua panoramica generale, il processo di micropropagazione, presenta una primissima difficoltà, che è quella del mantenere un ambiente asettico e privo di contaminanti esterni. La pulizia, la disinfettazione e la sterilizzazione degli spazi, degli strumenti utilizzati e di tutto ciò che va a comporre un laboratorio di TS deve essere il primo input precettivo. La mancata osservazione di questi input, potrebbe precludere un insuccesso già dalle primissime fasi del protocollo. Altrettanto importanti e fondamentali sono quei fattori ambientali come la temperatura, l’umidità e la qualità dell’impianto d’illuminazione.
Riguardo gli impianti d’illuminazione, recenti studi, hanno dimostrato che la qualità e la quantità della luce artificiale influenza le risposte morfogenetiche e ha effetti significativi su tutti i processi fisiologici. Ecco perché occorre fare una scelta razionale e mirata verso impianti luce con caratteristiche e spettri dedicati. Fino a poco tempo fa i più comunemente usati erano i tubi al neon (T5 e simili), oggi sostituiti nella maggior parte dei casi dai più performanti tubi LED.
Il grado di illuminazione più adatto per la cannabis è quello che va dai 4800°K ai 6500°K.

Analizziamo in maniera sommaria le fasi salienti che caratterizzano la produzione di cloni tramite la Tissue Colture, le attrezzature e i protocolli per lavorare correttamente e in sicurezza.

Le fasi salienti:
• preparazione piante donatrice
• stabilizzazione degli espianti
• moltiplicazione dell’espianto
• radicazione
• trapianto è acclimatazione

Piante madri

Preparazione delle piante donatrici
Prima di procedere con la riproduzione abbiamo l’esigenza di fare una scelta, ovvero quella di selezionare una pianta/e con caratteristiche note che sarà chiamata “donatrice”, o “pianta madre”. Si può ottenere una pianta madre a partire dal seme con successiva selezione dei soggetti, i futuri cloni creati saranno una replica geneticamente perfetta del donatore.
Un passo importante è quello relativo alla pulizia delle piante madri. Sappiamo infatti che arrivano da allevamenti esterni al laboratorio e quindi facilmente soggette a fattori inquinanti, quali agenti patogeni esterni, polveri che ospitano microrganismi, insetti e altre potenziali fonti di contaminazione comprese quelle trasportate dallo stesso grower. Per far sì che le donatrici siano prive di questi patogeni, prima del loro ingresso in laboratorio gli espianti saranno raccolti e conservati su soluzione di candeggina e tensioattivo in sacche del tipo Ziploc. Successivamente si proseguirà con un ulteriore lavaggio, sempre a base di candeggina e tensioattivi, per poi subire un risciacquo finale con acqua sterile poco prima della preparazione dei tagli per la riproduzione.

Stabilizzazione degli espianti
Il processo di stabilizzazione, come già accennato, richiede un ambiente assolutamente sterile. Gli espianti una volta sterilizzati e posti nel recipiente di coltura (preferibilmente vetro) vengono trasportati in un’autoclave. Con questa procedura, gli espianti sono sottoposti ad alte temperature e pressioni atte a favorire e ottenere una maggiore sterilità. Fatto ciò con le nuove condizioni asettiche si passa alla stabilizzazione, con il posizionamento su scaffale (preferibilmente di alluminio) sotto tubi luminosi (Neon-LED-CFL).
Come base classica del mezzo di coltura viene utilizzato il Murashige/Skoog. In questo stadio, vengono combinati fitoregolatori in grado di promuovere e favorire lo sviluppo dell’impianto, mentre Citochinine e Auxine sono aggiunte ai mezzi di coltura per favorire lo sviluppo dei germogli.

Cappa a flusso laminare

Moltiplicazione degli espianti
Questa operazione si esegue preferibilmente su cappa a flusso laminare orizzontale. In cappa, si andranno a rimuovere accuratamente gli espianti che verranno predisposti su capsule di Petri su terreni di coltura simili a quelli precedentemente utilizzati per favorire il loro accrescimento. Ulteriori arricchimenti di Citochine sono preferiti per la proliferazione di più germogli.
Durante questo processo possono anche essere prodotti germogli multipli mediante embriogenesi somatica o organogenesi direttamente sugli espianti. In un periodo di tempo compreso fra 4-6 settimane, i nuovi germogli sono pronti per la successiva fase di radicazione; oppure possono altresì essere sottoposti a una fase chiamata subcoltura, quindi moltiplicati su un substrato fresco per ottenere nuovi germogli.

Radicazione
Temperature e preparazione del substrato inclusi gli elementi che lo compongono sono fondamentali. La fase di radicazione conta di un periodo, detto di allungamento, della durata di circa 20 giorni. Il substrato utilizzato è lo stesso della fase 2, ma con una concentrazione molto ridotta di citochinine a fronte di una più elevata di acido gibberellico, auxine, zuccheri e sostanze minerali composte da macro e microelementi sono gli altri costituendi del mezzo di coltura.

Trapianto e acclimatazione
Il processo finale è quello attraverso il quale le piccole piante già radicate, precedentemente ottenute in vitro, vengono trasferite e acclimatate in condizioni di coltura esterna su serre o simili con parametri ambientali controllati. Un’alta umidità rimane sempre un fattore rilevante per l’acclimatamento e la crescita, mentre le temperature ideali variano dai 25 ai 28° C. In questa fase finale le piante sono sottoposte a un terreno di coltura e a un ambiente completamente diverso da quello precedente, pertanto è preferibile la scelta di un misto cocco/perlite.
Una volta che le piante iniziano la fase di vegetativa con la crescita dei nuovi getti e del nuovo apparato fogliare, possono essere trasferite in campo aperto per continuare il ciclo vitale.

Bibliografia e sitografia:
A micropropagation system for cloning of hemp (CANNABIS SATIVA L.) by SHOOT TIP CULTURE (REN WANG1, LI-SI HE1 -BING XIA1 -JIN-FENG TONG1 -NING LI2 AND FENG PENG1)
Plant Tissue Culture: Techniques and Experiments (Roberta H. Smith)
Studi preliminari sulla cultura dei tessuti della Cannabis sativa L. (Canapa industriale)
Scienze e tecnologie agricole. Maggio 2015, Vol. 16 Edizione 5, p923-925. 3p. Autori: Ying JIANG; Zunmin XIA; Yan TANG; Qiang HAN; Chengwei HAN
Plant Tissue Culture: Theory and Practice (S.S. Bhojwani, M.K. Razdan)
Plant Propagation by Tissue Culture: Volume 1. The Background (a cura di Edwin F. George, Michael A. Hall, Geert-Jan De Klerk)
Dispense varie del Dipartimento di Botanica e Scienze delle piante, Università della California, Riverside, CA 92521, USA.

a cura di Groow





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